Aproximaciones multidisciplinares incluyendo herramientas histológicas, bioquímicas y moleculares para estudiar los mecanismos de resistencia a marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum en guisante (Pisum sativum)

El guisante es una leguminosa-grano muy importante al nivel mundial que ha sido cultivada como fuente de proteínas para la nutrición animal y humana durante muchos siglos. Sin embargo, el rendimiento del guisante se ve reducido frecuentemente debido a estreses bióticos y abióticos. La marchitez vascular causada por Fusarium oxysporum f.sp. pisi (Fop) es una de las enfermedades más destructivas de este cultivo.
El uso de variedades resistentes es el método más seguro, más económico y más eficaz para controlar esta enfermedad. La constante evolución del patógeno implica la necesidad de ampliar la base genética de la resistencia a Fop. El éxito en la mejora genética por resistencia se basa en (i) la disponibilidad de variabilidad genética, disponible en colecciones de germoplasma, incluyendo entradas silvestres, (ii) la disponibilidad de técnicas de evaluación precisa y exacta y (iii) el conocimiento de la biología y la variabilidad de la planta y del patógeno así como de la interacción entre ambos. En el presente trabajo nos propusimos buscar y caracterizar nuevas fuentes de resistencia a Fop en una colección de germoplasma de Pisum spp. y profundizar en
el conocimiento de los mecanismos implicados en la resistencia a este patógeno mediante distintas aproximaciones. Con el fin de establecer una metodología estándar, fácil y útil para evaluar la resistencia de las leguminosas frente a Fusarium oxysporum, se realizó un estudio preliminar evaluando la respuesta fisiológica y la susceptibilidad a esta enfermedad de dos genotipos contrastantes de la planta modelo Medicago truncatula.

Para ello se evaluó el efecto de varias condiciones culturales conocidos por afectar la incidencia de la enfermedad tales como la edad de la planta en el momento de infección, el sustrato de crecimiento y el método de inoculación. Los resultados indicaron que el método de inoculación afecta fuertemente el desarrollo de la enfermedad mientras que la edad de la planta y los sustratos de crecimiento inorgánico probados no la afectaba significativamente. Este estudio permitió también poner a punto un método de inoculación de F. oxysporum que se utilizó posteriormente para evaluar la respuesta de una colección de germoplasma Pisum spp. frente un aislado de raza 2 de Fop.
El resultado de esta evaluación mostró una gran variabilidad en la respuesta de las entradas de guisante a la enfermedad lo que indica la expresión cuantitativa de la resistencia a Fop en nuestra colección. La repetición de los experimentos con 19 entradas, indicó que el método de inoculación y de evaluación era robusto y reproducible y confirmó la alta resistencia de 11 entradas. A continuación, se persiguió la caracterización de los mecanismos responsables de la resistencia en estas entradas de guisante.
En primer lugar, se recogieron los exudados radiculares de 12 entradas de guisante que presentan respuestas diferenciales a la raza 2 para determinar sus efectos sobre el crecimiento del patógeno. Mientras que los exudados de la mayoría de las entradas de guisante estimulaban la germinación de Fop, algunas entradas no lo hacían e incluso inhibían su germinación. Esto indicó que algunas entradas expresan un mecanismo constitutivo que actúan antes de la penetración y que podría contribuir a disminuir la población del patógeno. Este estudio permitió demostrar también que la pisatina contenida en los exudados de estas entradas juega un papel importante en este mecanismo de resistencia constitutiva.
Además de este mecanismo, el guisante ha desarrollado otros mecanismos que actúan durante y después de la penetración de las raíces. Las observaciones macroscópicas preliminares, muestran que, en todas las entradas resistentes, la progresión del patógeno está eficientemente bloqueado en la parte basal de la planta. Por ello se inició un estudio histológico para identificar los mecanismos de resistencia que actúan en la parte superior de la raíz de la planta a nivel celular. La comparación detallada de 8 entradas con respuesta diferencial a la raza 2 de Fop demostró que las entradas resistentes desarrollan varias barreras en la epidermis, exodermis, córtex, endodermis y la estela vascular que impiden eficientemente la progresión del patógeno. Se determinó que estas barreras se basan principalmente en tres mecanismos de defensa, el fortalecimiento de la pared celular por lignificación, la formación de papila en el sitio de penetración y la acumulación de diferentes sustancias entre y dentro de las células, y que estas barreras estaban expresadas diferencialmente en las entradas resistentes. Los principales componentes de estas diferentes barreras son los compuestos fenólicos, la lignina y los carbohidratos.
Nuestros resultados apoyan también la importancia de las enzimas de degradación de la pared celular en la patogenicidad de F. oxysporum. La caracterización molecular de la resistencia a través una aproximación proteómica confirma parcialmente estas observaciones. El análisis proteómico de tres genotipos con diferentes niveles de resistencia a la raza 2 de Fop, demostró la implicación de los compuestos fenólicos así como de las proteínas responsables del reforzamiento de la membrana y de la pared celular en la resistencia del guisante a Fop. Este análisis ha revelado también que la producción de especies reactivas de oxígeno no era suficiente para prevenir la colonización de la planta susceptible por el patógeno. Por otro lado, y para profundizar en el conocimiento sobre la patogenicidad de F. oxysporum se han estudiado los metabolitos secundarios producidos por algunos aislados de la raza 2 de Fop y su relación con la patogenicidad. Este estudio ha demostrado que estos aislados producen principalmente dos toxinas, el ácido fusárico y el ácido 9,10 dihydrofusárico. Ambas toxinas son fitotóxicas y la cuantidad de toxinas producidas por cada cepa está correlacionado con sus niveles de virulencia. Así, estos resultados indican claramente que estas toxinas son unos factores determinantes en la patogenicidad de la raza 2 de Fop.
Os dejamos unas fotos del evento: